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醫(yī)用光機電設備、手術器械
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醫(yī)用材料
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植入材料和人工器官
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口腔科設備及材料
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介入器材
MTT法:
1、將配制好的1×105/mL細胞懸液接種于96孔板,設空白對照、陰性對照、陽性對照和供試品組,每組各設至少6孔,每孔接種100uL細胞懸液,置CO2培養(yǎng)箱(含體積分數(shù)5%二氧化碳氣體)37℃培養(yǎng)24h。
2、 培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)液,空白對照組加入新鮮細胞培養(yǎng)液,陰性對照組加入陰性對照品浸提液,陽性對照組加入陽性對照溶液或陽性對照品浸提液,供試品組分別加入100uL不同濃度的樣品浸提液(100%、75%、50%、25%),置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。
3、 更換培養(yǎng)液24h后,置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。每孔加入50uL質(zhì)量濃度為1mg/mL的MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2h后棄去孔內(nèi)液體,加入100uL異丙醇,置振蕩器上振蕩,在酶標儀570nm和650nm波長下測定吸光度,計算相對增殖率(RGR)。
直接接觸法:
1、 將已培養(yǎng) 48h~72h 生長旺盛的細胞用消化液消化后加入細胞培養(yǎng)液,用移液槍吹打混勻后在顯微鏡下計數(shù),將細胞懸液配制成密度 1.0×105/mL,接種于直徑 35mm 培養(yǎng)皿,每皿 2mL,共 9 皿。置 CO2培養(yǎng)箱 (5%CO2,37℃,>90%濕度)培養(yǎng)至近匯合單層細胞形成。
2、 棄去原培養(yǎng)液。加入 2mL 新鮮培養(yǎng)基,在培養(yǎng)皿中央部位的細胞層上輕輕放置一片供試樣品,共 3 皿。 同法操作陰性對照、陽性對照各 3 皿。置 CO2培養(yǎng)箱(5%CO2,37℃,>90%濕度)繼續(xù)培養(yǎng) 24h。
3、 培養(yǎng)結(jié)束后,于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、空泡形成、脫落、細胞溶解和膜完整性等方面的變化,根據(jù)以下標準判斷試驗樣品分級,分級大于 2 級時被認為有細胞毒性作用。
瓊脂擴散法:
1、將已培養(yǎng)48h~72h生長旺盛的細胞用消化液消化后加入細胞培養(yǎng)液,用移液槍吹打混勻后在顯微鏡下計數(shù),將細胞懸液配制成密度1.0×105/mL,接種于直徑35mm培養(yǎng)皿,每皿2mL,共9皿。置CO2培養(yǎng)箱(5%CO2,37℃,>90%濕度)培養(yǎng)至近匯合單層細胞形成。
2、棄去器皿中的培養(yǎng)基,將溶化瓊脂與含血清的新鮮培養(yǎng)基混合,使瓊脂最終質(zhì)量濃度為0.5%~2%,并吸取適宜體積加入至每只培養(yǎng)皿內(nèi)。細胞培養(yǎng)只能使用適合于哺乳動物細胞生長的瓊脂。這種瓊脂/培養(yǎng)基的混合物宜為液態(tài),并且溫度適合于哺乳動物細胞。加入2mL中性紅液并在CO2培養(yǎng)箱孵育30min,孵育后丟棄多余的中性紅液,將試驗樣品的平行試樣小心地放在每只培養(yǎng)皿的固化瓊脂層上,確保試樣覆蓋細胞層表面約十分之一,共3皿。同法操作陰性對照、陽性對照各3皿。置CO2培養(yǎng)箱(5%CO2,37℃,>90%濕度)繼續(xù)培養(yǎng)24h。
3、培養(yǎng)結(jié)束后,將培養(yǎng)皿上的試樣小心地從固化瓊脂層取下,于顯微鏡下觀察培養(yǎng)皿中細胞形態(tài)、空泡形成、脫落、細胞溶解和膜完整性等方面的變化,根據(jù)表1判斷試驗樣品分級,分級大于2級時被認為有細胞毒性作用。
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| 醫(yī)用有機硅材料生物學評價試驗方法 | GB/T 16175-2008 5 |


